Доказательства иммуномодуляции, индуцированной пробиотиками

Доказательства иммуномодуляции, индуцированной пробиотиками

Глоссарий:
CDV: Canine Distemper Virus – Вирус Чумы Собак
IFA: Immunofluorescent Antibody Testing – Иммунофлуоресцентный Анализ

Введение


Пробиотики – это живые микроорганизмы, оказывающие оздоровительное воздействие при введении их пациенту в адекватных дозах.1 К настоящему времени уже проведено множество исследований влияния пробиотиков на здоровье людей, однако воздействия их на мелких домашних животных пока изучены мало. В обзорах исследований о влиянии пробиотиков на людей указываются следующие установленные и подтвержденные эффекты их применения:

1. предотвращение и / или сокращение продолжительности жалоб на вирусную или ассоциированную с антибиотиками диарею, а также ослабление расстройств, вызванных непереносимостью лактозы;

2. снижение концентрации канцерогенных метаболитов и / или гнилостных (бактериальных) метаболитов в кишечнике;

3. профилактика нарушений работы желудочно-кишечного тракта и снижение числа неспецифических и нерегулярных расстройств его работы у клинически здоровых людей;

4. благотворное воздействие на микробные аберрации, в процессе воспаления и других нарушений, связанных с воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта, инфекцией Helicobacter pylori или избыточным бактериальным разрастанием;

5. нормализация частоты стула и его консистенции у лиц, страдающих констипацией;

6. профилактика и /или облегчение проявлений аллергических реакций и атопических заболеваний у младенцев;

7. профилактика инфекций дыхательных путей (простуды, гриппа) и других инфекционных заболеваний, а также лечение урогенитальных инфекций.

Иммуноопосредованные и инфекционные заболевания достаточно распространены у мелких животных, и поэтому предполагаемые положительные результаты применения по отношению к ним пробиотиков, способных модулировать иммунитет, смогли бы существенно облегчить работу ветеринарного врача. Механизмы иммуномодуляции пока еще не полностью охарактеризованы, но понятно, что многие положительные эффекты зависят от применения пробиотика. Некоторые пробиотики могут благоприятным образом системно воздействовать на врожденный и приобретенный иммунитет с помощью различных имеющихся механизмов, включая индицирование производства различных типов цитокинов и естественной активности клеток-киллеров, а также производство иммуноглобулинов.2

В ряде недавних обзорных статей в области медицины человека указывается на имеющиеся свидетельства что благотворное влияние пробиотиков на состояния людей при вызванной Clostridium difficille диарее и внутрибольничной пневмонии является минимальным, и поэтому должны быть выполнены более масштабные, строго контролируемые исследования в этой области на нескольких научных площадках.

При этом подчеркивается, что биологические эффекты применения отдельных пробиотиков могут быть отличными друг от друга и поэтому действие каждого вводимого пробиотика должно быть строго зафиксировано и изучено с целью определения потенциала его клинической полезности.3 4 5

Кроме того, следует учитывать источник получения пробиотика. Например, в ходе недавнего исследования было установлено, что большинство продуктов, претендовавших на содержание в них пробиотиков, при тестировании, как правило, не выявляли соответствия тому, что было указано на их этикетках.6 7 Исключение составляет пробиотик Enterococcus faecium SF68 (FortiFlora) Purina Pro Plan Veterinary Diets. Недавно было установлено, что этот продукт при его надлежащем хранении даже через несколько лет после производства по-прежнему соответствует содержанию живых бактерий, которое было заявлено на его этикетке.

Потенциальная польза иммуномодулирующих пробиотиков для здоровья животных может быть существенной.8 Имеется целый ряд доказанных подтверждений иммуномодулирующих свойств некоторых пробиотиков, связанных с лечением атопии и/или воспалительных заболеваний кишечника у людей и собак.8 9 10 11 12 13

Enterococcus faecium SF68 (NCIMB10415) был изначально выделен из кала здорового ребенка, и была показана его ингибирующая активность в отношение роста ряда энтеропатогеных организмов.14 Целью данного обзора является обобщение основных выводов, сделанных как в более ранних, так и в недавних исследованиях в отношении потенциальных иммуномодулирующих свойств пробиотиков.

Исследования пробиотикассоциированной модуляции иммунитета у собак


В ходе исследования штамм Enterococcus faecium SF68 скармливали группе щенков, вакцинированных против вируса чумы плотоядных (CDV), а через некоторое время полученные результаты сравнивали с результатами контрольной группы, где щенки были аналогичным образом вакцинированы, но им не давали пробиотика.15

Ряд полученных результатов свидетельствуют об иммуномодулирующем эффекте применения пробиотика. Щенки, получившие SF68, показали повышенные концентрации сывороточного и фекального общего IgA, повышенные концентрации CDV-специфических IgG и IgA в сыворотке крови, а также более высокий процент циркулирующих -лимфоцитов по сравнению со щенками контрольной группы.

Влияние пробиотика на уровень CDV-специфических IgG и IgA антител в сыворотке крови наблюдалось у щенков только после того, как им давали добавки в течение 31 и 44 недель. Также полагают, что SF68 предотвращал снижение титров антител, которое наблюдалось в контрольной группе, поддерживая высокий уровень антител у щенков, получавших этот пробиотик. Клинические наблюдения показали, что иммунная модуляция, индуцированная SF68, может произойти раньше, чем через 10 недель. Так, недавно в Центре изучения домашних животных было проведено двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование здоровых молодых биглей. По причинам имеющихся издательских ограничений мы представим здесь лишь наиболее общие из данных, полученных в ходе исследования, тогда как более подробный обзор результатов будет произведен позднее. Использование проточной цитометрии для измерения клеточных результатов и оценочной панели основных цитокинов позволило исследователям получить доказательства иммуномодуляции, индуцированной пробиотиком, уже через 4 недели после его введения.16

Еще в одном исследовании, проводимом в Центре изучения домашних животных, анализируется влияние E. faecium SF68 на состояние американских пит бультерьеров с генерализованным демодекозом. Результаты исследования также будут представлены позднее

Исследования иммунной модуляции у котят


В другом исследовании экспериментальный проект по оценке реакций на вакцинацию, аналогичный тому, который был применен к щенкам, был вновь применен при изучении группы котят.17

В этом исследовании было выдвинуто предположение, что кормление котят с добавлением Е. faecium SF68 будет способствовать повышению у них неспецифической иммунной реакции, FHV-1, FCV и FPV- специфического гуморального иммунного ответа, а также FHV-1- специфической клеточной иммунной реакции. У коммерческого поставщика были приобретены двадцать котят 6-недельного возраста, которых затем поделили на две группы. Далее одной группе котят ежедневно давали SF68, а другой группе, начиная с 7-недельного возраста, давали плацебо. В возрасте 9 и 12 недель котятам ввели имеющуюся в продаже коммерческую FVRCP-модифицированную живую вакцину и далее отслеживали их состояние до возраста 27 недель. За поведением котят следили ежедневно на протяжении всего исследования. Вес тела котят измеряли еженедельно. Кровь, слюну и фекалии собирали у всех котят перед тем, как начать давать пробиотик одним и плацебо другим в возрасте 7, 9, 15, 21 и 27 недель. Кроме того, были собраны фекалии у котят в опытной группе, когда котятам исполнилось 28 недель.

В каждой из двух групп методом случайной выборки собирали по пять образцов кала в день из общего лоточка и производили подсчеты с использованием стандартизированной графической карты оценки фекалий. Фекальные экстракты из образцов, взятых у котят в возрасте 9 и 27 недель, были проанализированы на общее количество IgA и общей фракции иммуноглобулинов. Прочие контролируемые параметры изучались методом случайной выборки, в том числе амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) - ПЦР в фекалиях, с целью определить, имелся ли жизнеспособный E. faecium SF68 в стуле котят, получавших пробиотик, а также выяснить, не был ли пробиотик случайно передан котятам из группы, получавшей плацебо.

Имеющиеся в продаже ELISA тесты были использованы для определения присутствия энтеротоксинов Clostridium perfringens или C. difficile токсинов A / B в фекалиях котят.

Были выполнены обычные тесты на присутствие аэробных фекальных культур типа Salmonella spp.и Salmonella spp. и Campylobacter spp. Были также выполнены общий и биохимический анализы крови и анализ мочи котят для оценки возможных нежелательных проявлений, вызванных употреблением пробиотика. Антигенспецифические гуморальные иммунные реакции оценивали измерением сывороточных FHV-1-специфичных IgG, FHV-1-специфичных IgA, FCV-специфического IgG, а также панлейкопения-специфических IgG в сыворотке и FHV-1 специфических уровней IgG и IgA в слюне котят. Измерения проводились посредством ELISA (вариация ИФА). Общие концентрации IgG и IgA в сыворотке, фекальных экстрактах и слюне были выявлены посредством использования коммерчески доступных ELISA тестов или методом радиальной иммунодиффузии. Клеточный иммунный ответ оценивали с помощью проточной цитометрии и анализа маркеров пролиферации. Лимфоциты были окрашены для выявления маркеров CD4, CD8, CD44, MHC класса II и B клеток. Кроме того, оценке подверглась пролиферация лимфоцитов как ответ на конканавалин A (лектин, стимулятор митоза лимфоцитов) и FHV-1 антигены.

Общие анализы крови и биохимические профили у всех котят были в пределах нормы соответствующей возрастной группы на всем протяжении времени их измерения, Некоторые иммунные маркеры были в количественном измерении выше у получавших SF68 -котят по сравнению с группой плацебо. Например, у котят 21 и 27 -недельного возраста в контрольной группе средние уровни FHV-1-специфического IgA в сыворотке крови и слюне оказались выше по сравнению с котятами из группы плацебо. Более того, средние FHV-1-специфические уровни IgG сыворотки у котят в возрасте15, 21 и 27 недель в контрольной группе тоже оказались выше в сравнении с группой плацебо. В 15-недельном возрасте у котят в группе контроля уровень сывороточного FPV-специфического IgG также оказался выше, чем у котят в группе плацебо. Каких-либо статистических различий между двумя группами в отношении любых поверхностных клеточных маркеров в первых четырех измеряемых временных точках выявлено не было. Однако, на 27-неделе у котят группы из группы контроля был выявлен значительно более высокий процент CD4 -позитивных лимфоцитов (средний 13,87%), чем у котят группы плацебо (средний 10.61%, p = 0.0220).

В этом исследовании мы пришли к выводу о безопасности SF68 для кошек, а увеличение числа CD4+ клеток в SF68 группе по сравнению с группой плацебо без одновременного увеличения количества CD8+ у котят в возрасте 27 недель, что демонстрирует системные иммуномодулирующие действия пробиотика. Поскольку не было выявлено значительного увеличения в лимфоидной стимуляции, вызванной FHV-1 или увеличения экспрессии маркера клеток памяти - CD44 на CD4+ лимфоцитах в группе котят, получавших пробиотик, то увеличение содержания лимфоцитов CD4+, возможно, было неспецифичным.

Поскольку лимфоциты CD4+ у котят, участвовавших в исследовании, не были дополнительно охарактеризованы через специфические профили цитокинов или посредством дополнительной характеристики маркеров поверхности клеток (CD), то невозможно было с точностью определить, какая из реакций - Th1 или Th2 индуцированная – стала преобладающей. Мы посчитали, что размер выбранной группы и / или продолжительность исследования, возможно, помешали установлению точных статистических различий между обеими группами котят в отношении титров антител FPV, FCV и FHV-1.

Изучение хронического вируса герпеса 1 у кошек


Поскольку в исследовании, проведенном на здоровых котятах, было выявлено потенциальное влияние E. faecium SF68 на клеточный иммунитет кошек, мы решили также изучить его потенциальное воздействие на кошек с вирусом герпеса 1 (FHV-1).18

Этот вирус чрезвычайно распространен у кошек и часто связан с болезненными ощущениями по причине рецидивирующих глазных и респираторных клинических проявлений заболевания. Кроме того, пока не выработана полностью эффективная лекарственная терапия, причем вакцинация также не обеспечивает развития достаточного и стойкого (полного) иммунитета.

В этом исследовании было выдвинуто предположение о том, что добавление SF68 в рацион питания может со временем ослабить клиническое течение заболевания и выделения FHV-1 и ДНК FHV-1 у FHV-1 инфицированных кошек.

В выборке из 12 кошек с хронической инфекцией FHV-1 животным в рацион питания добавляли либо SF68, либо плацебо; далее проводился мониторинг клинических признаков заболевания, шеддинга вирионов FHV-1 и оценка FHV-1-специфических гуморальных и клеточно-опосредованных иммунных реакций. После достаточно спокойного периода у кошек были спровоцированы состояния незначительного стресса посредством многократного изменения содержания животных то в вольерах, то в свободном групповом содержании на протяжении 5 месяцев.

SF68 хорошо переносился всеми кошками. Разнообразие фекальных микроорганизмов сохранялось на протяжении всего исследования у кошек, получавших SF68, но уменьшалось у кошек, получавших плацебо, что указывает на более стабильный микробиом у кошек, которых кормят SF68. Признаки заболевания верхних дыхательных путей не усугублялись в условиях созданной модели стресса. Хотя показатели у кошек варьировались, те из них, кто в течение всего периода прикармливания получали SF68, демонстрировали меньше эпизодов конъюнктивита, чем кошки, получавшие плацебо. Это позволило предположить, что введение пробиотика уменьшило ассоциированные болезненные проявления у кошек с хронической инфекцией FHV-1 в условиях стресса.

Исследование острого лямблиоза у мышей


В исследовании мыши, которым давали SF68, а затем заражали кишечными лямблиями выделяли меньше трофозоитов и меньше определяемых специфических антигенов лямблий, чем мыши из группы, получавшей плацебо. Кроме того, мыши, получавшие SF68, показали рост числа CD4+ клеток в пейеровых бляшках и селезенке, а также рост кишечного анти-лямблиего IgA и сывороточного IgG по сравнению с мышами из группы, получавшей плацебо.

Исследование острой неспецифической диареи у приютских животных


В недавнем исследовании мы предположили, что размещенные в приюте для животных кошки и собаки, получавшие SF68, должны были реже страдать от диареи и иметь лучшие фекальные показатели по сравнению с другими приютскими кошками и собаками, которые не получали SF68. Кошки жили в двух разных помещениях. Собаки были размещены в двух разных помещениях в Северо- Колорадском Приюте для животных. Кошек и собак кормили в соответствии со стандартизированной диетой для этих видов животных. Животным в одном помещении ежедневно давали добавки, содержавшие E. faecium SF68, а животным в другой группе ежедневно давали плацебо. Во всех остальных отношениях условия содержания животных были одинаковыми. Для того, чтобы уменьшить риск влияния условий обитания на результаты исследования, помещение, в котором находились кошки или собаки, получавшие добавку E. faecium SF68, сменили по прошествии одного месяца и провели недельную санитарную обработку прежнего помещения, чтобы возможные следы SF68 в окружающей среде не повлияли на результаты исследования.

Во время исследования проводились плановые уборки и дезинфекция помещения по общим правилам. Перед уборкой комнаты каждое утро фекалии в клетке каждого животного собирались и анализировались одним из исследователей с использованием системы оценки кондиции фекалий. Этот человек не знал, где и какие животные были размещены. После анализа фекалии собак с показателями от 4 до 7 (что указывает на легкую, среднюю или тяжелую форму диареи) были собраны и отправлены в Университет штата Колорадо для тестирования на наличие в них инфекций. Анализ включал микроскопическое исследование для выявления наличия яиц паразитов, и ооцист методом флотационного сульфат-цинкового центрифугирования, а также тестирование с помощью иммунофлуоресцентного анализа (IFA) на ооцисты криптоспоридий и цисты лямблий (MerifluorR Cryptosporidium/Giardia, Meridian BioscienceInc., Cincinnati, OH). Процент собак или кошек с продолжительностью диареи >2 дней подсчитывали в течение всего периода исследования. Обобщенная смешанная линейная модель, применявшаяся для оценки статистических различий между группами кормления, учитывала случайность выбора помещения содержания и постоянство формулы кормления животных. Возможность присутствия паразитов была учтена. Было установлено значение p < 0.05.

Показатели диареи были низкими у всех тестируемых собак, статистических различий не было выявлено. Однако процент кошек с диареей >2 дней составил 7,7% в группы, получавшей пробиотики, и 20,7% в группе, получавшей плацебо. Этот результат отличался существенно (Р = 0,0297). Полученные результаты свидетельствуют о том, что SF68 для кошек, размещенных в приютах, может уменьшить для них число дней с диареей. Поскольку это было краткосрочное исследование, полученные результаты, возможно, были вызваны влиянием пробиотика на микрофлору кишечника, и их следует с осторожностью расценивать как системное иммуномодулирующие эффекты от его применения.

Резюме и выводы


Собранные на сегодняшний день доказательства свидетельствуют о том, что E. faecium SF68 оказывает иммуномодулирующие воздействия на собак и кошек и может быть эффективен в качестве вспомогательного средства для лечения некоторых клинических расстройств.

Дополнительные данные необходимы для детализации диапазона иммунной модуляции и получения сравнительных данных анализа действия разных пробиотиков.

Автор перевода: Анатолий Черников – главный ветеринарный врач, Клиника «101 Далматинец», Москва

Список литературы:

1. Schrezenmeir J, De Vrese M. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics — Approaching a Definition. Am J Clin Nutr. 2001; 73:361S-364S.

2. De Vrese M, Scherezenmeir J. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Adv Biochem Eng Biot. 2008; 111:1-66.

3. McNabb B, Isakow W. Probiotics for the Prevention of Nosocomial Pneumonia: Current Evidence and Opinions. Curr Opin Pulm Med. 2008; 14:168-175.

4. Dendukuri N, Costa V, McGregor M, Brophy JM. Probiotic Therapy for the Prevention and Treatment of Clostridium difficile-Associated Diarrhea: A Systematic Review. Can Med Assoc J. 2005; 173:167-170.

5. Isakow W, Morrow LE, Kollef MH. Probiotics for Preventing and Treating Nosocomial Infections: Review of Current Evidence and Recommendations. Chest. 2007; 132:286-294.

6. Weese JS, Arroyo L. Bacteriological Evaluation of Dog and Cat Diets that Claim to Contain Probiotics. Can Vet J. 2003;44:212.

7. Weese JS, Martin H. Assessment of Commercial Probiotic Bacterial Contents and Label Accuracy. Can Vet J. 2011; 52: 43-46.

8. Wynn SG. Probiotics in Veterinary Practice. J Am Vet Med Assoc. 2009; 234:606-613.

9. Kim H, Rather IA, Kim H, et al. A Double-Blind, Placebo Controlled-Trial of a Probiotic Strain Lactobacillus sakei Probio-65 for the Prevention of Canine Atopic Dermatitis. J Microbiol Biotechn. 2015; 25:1966-1969.

10. Ohshima-Terada Y, Higuchi Y, et al. Complementary Effect of Oral Administration of Lactobacillus paracasei K71 on Canine Atopic Dermatitis. Vet Dermatol. 2015; 26:350-353.

11. Ganji-Arjenaki M, Rafieian-Kopaei M. Probiotics Are a Good Choice in Remission of Inflammatory Bowel Diseases: A Meta Analysis and Systematic Review. J Cell Physiol. 2017(Mar 15). doi:10.1002/jcp.25911 (Epub ahead of print)

12. Forbes A, Escher J, Hébuterne X, et al. ESPEN Guideline: Clinical Nutrition in Inflammatory Bowel Disease. Clin Nutr. 2017; 36:321-347.

13. Rossi G, Pengo G, Caldin M, et al. Comparison of Microbiological, Histological, and Immunomodulatory Parameters in Response to Treatment with Either Combination Therapy with Prednisone and Metronidazole or Probiotic VSL#3 Strains in Dogs with Idiopathic Inflammatory Bowel Disease. PLOS One. 2014; 9(4):e94699.

14. Lewenstein A, Frigerio G, Moroni M. Biological Properties of SF68, a New Approach for the Treatment of Diarrhoeal Disease. Curr Ther Res. 1979; 26:967-974.

15. Benyacoub J, Czarnecki-Maulden GL, Cavadini C, et al. Supplementation of Food with Enterococcus faecium (SF68) Stimulates Immune Functions in Young Dogs. J Nutr. 2003; 133:1158.1162.

16. Lappin MR, Coy J, Hawley JR, Dow S. Effect of a Commercially Available Probiotic on Immune Responses in Healthy Dogs. J Vet Immunol Immunopathol. 2017. (In review)

17. Veir JV, Knorr R, Cavadini C, et al. Effect of Supplementation with Enterococcus faecium (SF68) on Immune Functions in Cats. Vet Therapeutics. 2007; 8:229.

18. Lappin MR, Veir JK, Satyaraj E, Czarnecki-Maulden G. Pilot Study to Evaluate the Effect of Oral Supplementation of Enterococcus faecium SF68 on Cats with Latent Feline Herpesvirus 1. J Feline Med Surg. 2009; 11:650-654.

19. Benyacoub J, Perez PF, Rochat F, et al. Enterococcus faecium SF68 Enhances the Immune Response to Giardia intestinalis in Mice. J Nutr. 2005; 135:1171.

20. Simpson KW, Rishniw M, Bellosa M, et al. Influence of Enterococcus faecium SF68 Probiotic on Giardiasis in Dogs. J Vet Intern Med. 2009; 23:476-481.

21. Bybee SN, Scorza AV, Lappin MR. Effect of the Probiotic Enterococcus faecium SF68 on Presence of Diarrhea in Cats and Dogs Housed in an Animal Shelter. J Vet Intern Med. 2011; 25:856-860.